因媚药“回春丸”的副作用导致了人员死亡。就在受害者家属围攻回春丸的制造方“上总屋”之际，上总屋的老板九兵卫及其女儿阿雪却下落不明。时光流转，三年过去了…… 与三味线屋勇次一同在柳桥顺利完成了处决乌山检校任务的“必杀工作人”弥助，在阿丰经营的路边摊“通宵达旦（夜明かし）”收留并照顾了名为丈吉的青年及其年幼的弟弟。当晚，弥助前往鸟越准备解决目标岩松，却被一位被称为“老师”的浪人抢先一步，眼看着岩松被杀。 因回春丸副作用失去父亲的才藏，查出路边摊的老板娘阿丰正是失踪的上总屋之女阿雪。原来，当初投河自尽的阿雪被弥助救下，随后改名阿丰苟活于世。才藏借回春丸之事责难阿丰，但在勇次的劝阻下愤然离去。 某日，叶屋的老板突然病倒，恰在现场的才藏心生一计，潜入了药材批发商“富喜屋”的疗养所。在那里，才藏得知富喜屋至今仍在贩卖回春丸，并将因药致残的患者藏匿起来的事实。此外，富喜屋为了逼问回春丸的配方，将上总屋九兵卫抓捕并囚禁。九兵卫将揭露真相的重任托付给才藏后自尽，而被富喜屋手下发现并逃出的才藏，也在偶遇勇次并将真相和盘托出后气绝身亡。 目睹了阿丰之父九兵卫的死以及富喜屋的恶行，弥助提议勇次一同去收拾富喜屋一伙。然而，察觉到弥助与阿丰已私定终身的勇次，认为“杀手若夹带私情便会迷失双眼，眼一旦迷失则必会失手”，因而拒绝了这桩生意。 弥助虽然暂时接受了勇次的说法，但最终还是找来了当初杀死岩松的杀手内田平内作为同伙，杀进了富喜屋。然而，即便目标近在咫尺，他还是中了火盗改方（江户特警）长官坂卷重次郎的奸计。被捕后的弥助向恶人们宣告了“职业杀手”的恐怖之处后，自尽而亡。 在弥助示众的首级前，伫立着悲痛欲绝的阿丰，以及承载了二人无尽遗憾的勇次等一众杀手们的身影。
